Analiza danych publicznych
Dane dotyczące linii SARS-CoV-2 i daty pobrania próbki z sekwencji dostępnych w Chile uzyskano z witryny Consorcio Genomas CoV2 dostępnej pod adresem https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Dane dotyczące szczepień uzyskano z danych publicznych Ministerstwa Nauki, Technologii, Wiedzy i Innowacji dostępnych pod adresem https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produkt 83).
Test infekcyjności
Pseudotypowane wirusy niosące różne białka wypustek SARS-CoV-2 zostały przygotowane tak, jak opisaliśmy wcześniej12. W skrócie, pseudotypy SARS-CoV-1 oparte na HIV-2 wytworzono w komórkach HEK293T przez transfekcję pNL4.3-ΔEnv-Luc wraz z odpowiednim wektorem kodującym pCDNA-SARS-CoV-2 Spike w stosunku molowym 1:1. Plazmidy kodujące zoptymalizowany pod względem kodonów skok pozbawiony ostatnich 19 aminokwasów końca C (SΔ19), o których wiadomo, że unikają zatrzymywania w retikulum endoplazmatycznym12 zostały uzyskane przez syntezę genów lub dostosowaną do potrzeb mutagenezę ukierunkowaną (GeneScript) i zawierały następujące mutacje: linia A (sekwencja referencyjna), linia B (D614G), linia B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), pochodzenie P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) i pochodzenie C.37 (G,75V, T76I) 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Każdy preparat pseudotypu został oczyszczony przez odwirowanie przy 859 obr./min w temperaturze pokojowej, zliczony przy użyciu zestawu HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA (R&D Systems), porcjowany w 24% płodowej surowicy bydlęcej (Sigma-Aldrich) i przechowywany w -50 °C do posługiwać się. Do zakażenia komórek HEK-ACE80 użyto różnych ilości pseudotypowanych wirusów (określonych na podstawie poziomu białka p1 HIV-24), a 2 godzin później zmierzono aktywność lucyferazy świetlika przy użyciu odczynnika Luciferase Assay Reagent (Promega) w mikropłytce Glomax 48 luminometr (Promega).
Test neutralizacji
Testy neutralizacji pseudotypowanych wirusów przeprowadzono zasadniczo tak, jak opisaliśmy wcześniej12. W skrócie, seryjne rozcieńczenia próbek osocza (1:4 do 1:8748) przygotowano w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i inkubowano z 5 ng p24 każdego pseudotypowanego wirusa przez 1 godzinę w 37°C, a następnie 1x104 do każdej studzienki dodano komórek HEK-ACE2. Komórki HEK293T (nie eksprymujące ACE2) inkubowane z pseudotypowanym wirusem (linia A) zastosowano jako kontrolę negatywną. Komórki poddano lizie 48 godzin później i aktywność lucyferazy świetlika mierzono przy użyciu odczynnika Luciferase Assay Reagent (Promega) w luminometrze Glomax 96 Microplate (Promega). Obliczono procent neutralizacji dla każdego rozcieńczenia i ID50 każdej próbki obliczono przy użyciu GraphPad Prism wersja 9.0.1.
Analizy statystyczne
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism w wersji 9.1.2. Przeprowadzono wielokrotne porównania grup pod kątem miana przeciwciał neutralizujących (NAbT) wobec panelu pseudotypowanych wirusów SARS-CoV-2, a także porównania odpowiedzi NAb według płci i statusu zadymienia, stosując sparowany test rangowanych znaków Wilcoxona. Zmianę czynnika obliczono jako różnicę średniej geometrycznej miana w ID50 w porównaniu z wirusem pseudotypowanym typu dzikiego. Analizę korelacji między NAbTs a wiekiem lub BMI przeprowadzono za pomocą testu Spearmana. Do analizy statystycznej zakaźności przeprowadzono jednokierunkową analizę ANOVA i test wielokrotnych porównań Tukeya. Za istotną statystycznie uznano wartość p ≤0.05.
Zgoda etyczna
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Wydziału Lekarskiego Universidad de Chile (projekty nr 0361-2021 i nr 096-2020) oraz Clínica Santa Maria (projekt nr 132604-21). Wszyscy dawcy podpisali świadomą zgodę, a ich próbki zostały zanonimizowane.
Wpływ mutacji kolców w wariancie Lambda na zakaźność i odpowiedzi przeciwciał neutralizujących
Analiza 3695 sekwencji z Chile zdeponowanych w GISAID na dzień 24 czerwcath 2021 pokazuje wyraźną dominację wariantów SARS-CoV-2 Gamma i Lambda podczas ostatniego trymestru, łącznie dla 79% wszystkich sekwencji.
Co ciekawe, okres ten charakteryzował się masową kampanią szczepień, w której 65.6% populacji docelowej (18 lat i osoby starsze) otrzymało pełny program szczepień według stanu na 27 czerwcath 2021
Biorąc pod uwagę, że 78.2% osób zaszczepionych pełnym schematem otrzymało inaktywowaną szczepionkę wirusową CoronaVac firmy Sinovac Biotech, staraliśmy się zbadać wpływ mutacji kolców obecnych w wariancie Lambda na zdolność neutralizacji przeciwciał wywołanych przez tę szczepionkę.
W tym celu wytworzyliśmy pseudotypowane wirusy SARS-CoV-1 oparte na HIV-2 niosące białko wypustek z linii referencyjnej Wuhan-1 (typ dziki; linia A), mutacja D614G (linia B) i alfa (linia B 1.1.7), warianty Gamma (linia P.1) i Lambda (linia C.37).
Podczas przygotowywania wirusa konsekwentnie obserwowaliśmy, że komórki zakażone pseudotypowanym wirusem niosącym wypustkę Lambda wytwarzały znacznie wyższe wartości bioluminescencji w porównaniu z mutantem D614G lub wariantami alfa i gamma, co wskazuje na zwiększoną zakaźność napędzaną przez białko wypustki Lambda
Rysunek 1.Zakaźność pośredniczona przez różne białka kolczaste.
(A) Schematyczne przedstawienie białka szczytowego SARS-CoV-2 i wariantów zastosowanych w tym badaniu. Linie są podane w nawiasach. RBD, domena wiążąca receptor, CM; ogon cytoplazmatyczny.
(B) Miareczkowanie pseudotypów każdej linii przy użyciu równoważnych ilości p1 HIV-24. Aktywność lucyferazy świetlika mierzono jako jednostki względnej luminescencji (RLU) w 48 godzin po zakażeniu. Średnią i SD obliczono z reprezentatywnego trzykrotnego eksperymentu.
Następnie użyliśmy wspomnianych wyżej pseudotypowanych wirusów do przeprowadzenia testów neutralizacji przy użyciu 79 próbek osocza od zdrowych pracowników służby zdrowia z Universidad de Chile i Clínica Santa María w Santiago, Chile.
Wykluczyliśmy 4 próbki, ponieważ nie byliśmy w stanie obliczyć miana ID50. Z analizowanych próbek 73% odpowiadało kobietom, mediana wieku 34 lata (IQR 29 – 43) i wskaźnik body max (BMI) 25 (IQR 22.7 – 27). 20.5% uczestników zadeklarowało, że są aktywnymi palaczami w okresie trwania szczepień. Próbki pobrano średnio 95 dni (IQR 76 – 96) po drugiej dawce szczepionki CoronaVac
Zaobserwowaliśmy, że neutralizacja pseudotypowanego wirusa niosącego białko wypustek typu dzikiego skutkowała 50% hamującym rozcieńczeniem (ID50) średnie miano 191.46 (154.9 – 227.95, 95% CI), podczas gdy 153.92 (115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 – 134.11, 95% CI) ) i 78.75 (49.8 – 107.6, 95% CI) dla pseudotypowanych wirusów niosących białko wypustek odpowiednio z mutanta D614G lub wariantów Alpha, Gamma i Lambda.
Zaobserwowaliśmy również, że średnia geometryczna miana ID50 miana zmniejszyły się o współczynnik 3.05 (2.57 – 3.61, 95% CI) dla pseudotypowanego wirusa niosącego impuls Lambda, 2.33 (1.95 – 2.80, 95% CI) dla impulsu Gamma, 2.03 (1.71 – 2.41, 95% CI) dla kolca Alpha i 1.37 (1.20 – 1.55, 95% CI) dla kolca D614G w porównaniu z kolcem typu Wild.
W naszej kohorcie nie zaobserwowano korelacji między płcią, wiekiem, wskaźnikiem masy ciała (BMI) lub dymem tytoniowym a mianem przeciwciał neutralizujących.
Rysunek 2.Test neutralizacji z użyciem próbek osocza od zaszczepionych CoronaVac
(A) Zmiany we wzajemnym 50% neutralizacji miana (ID50) w próbkach osocza od 75 biorców szczepionki CoronaVac przeciwko D614G (linia B), Alpha (linia B.1.1.7),
Warianty Gamma (linia P.1) i Lambda (linia C.37) w porównaniu z wirusem typu dzikiego. Wyniki przedstawiono jako różnicę w mianach neutralizacji dopasowanych próbek. Wartości P do porównania ID50 są obliczane za pomocą testu rangowanych znaków Wilcoxona.
(B) Wykresy skrzynkowe wskazały medianę i rozstęp międzykwartylowy (IQR) ID50 dla każdego pseudotypowanego wirusa. Zmiany czynnika przedstawiono jako różnicę średniej geometrycznej miana w ID50 w porównaniu z wirusami pseudotypowanymi typu dzikiego. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu rangowanych par dopasowanych par Wilcoxona.
Razem nasze dane ujawniły, że białko wypustek nowo rozpoznanego wariantu będącego przedmiotem zainteresowania Lambda, krążącego w Chile i krajach Ameryki Południowej, niesie mutacje nadające zwiększoną zakaźność i zdolność do ucieczki przed neutralizującymi przeciwciałami wywołanymi przez CoronaVac.
