Czas śmierci: nowa technologia potrzebna do większej dokładności

Dla naukowców, którzy badają neurodegenerację, ten brak dokładnej deklaracji „czasu śmierci” dla neuronów utrudnia ustalenie, jakie czynniki prowadzą do śmierci komórki i przesiewanie leków, które mogą uratować starzejące się komórki przed śmiercią.              

Teraz naukowcy z Gladstone Institutes opracowali nową technologię, która pozwala im śledzić tysiące komórek jednocześnie i określać dokładny moment śmierci dowolnej komórki w grupie. Zespół wykazał w artykule opublikowanym w czasopiśmie Nature Communications, że podejście to działa w komórkach gryzoni i ludzi, a także w żywym danio pręgowanym i może być wykorzystywane do śledzenia komórek przez okres tygodni lub miesięcy.

„Uzyskanie dokładnego czasu zgonu jest bardzo ważne dla wyjaśnienia przyczyny i skutku w chorobach neurodegeneracyjnych” – mówi dr Steve Finkbeiner, dyrektor Centrum Systemów i Terapii w Gladstone i starszy autor obu nowych badań. „Pozwala nam to dowiedzieć się, które czynniki bezpośrednio powodują śmierć komórki, które są przypadkowe, a które mogą radzić sobie z mechanizmami opóźniającymi śmierć”.

W artykule towarzyszącym opublikowanym w czasopiśmie Science Advances naukowcy połączyli technologię czujników komórkowych z podejściem do uczenia maszynowego, ucząc komputer, jak rozróżniać żywe i martwe komórki 100 razy szybciej i dokładniej niż człowiek.

„Ręczna analiza tego rodzaju danych zajęła studentom kilka miesięcy, a nasz nowy system działa niemal natychmiast — w rzeczywistości działa szybciej, niż jesteśmy w stanie pozyskać nowe obrazy za pomocą mikroskopu” — mówi dr Jeremy Linsley, kierownik programu naukowego w Finkbeiner's. laboratorium i pierwszym autorem obu nowych artykułów.

Uczenie starego czujnika nowych sztuczek

Kiedy komórki umierają – bez względu na przyczynę lub mechanizm – ostatecznie ulegają fragmentacji, a ich błony ulegają degeneracji. Ale ten proces degradacji wymaga czasu, co utrudnia naukowcom rozróżnienie między komórkami, które już dawno przestały funkcjonować, tymi, które są chore i umierające, a tymi, które są zdrowe.

Badacze zazwyczaj używają znaczników fluorescencyjnych lub barwników do śledzenia chorych komórek pod mikroskopem w czasie i próbują zdiagnozować, gdzie się znajdują w procesie degradacji. Opracowano wiele barwników wskaźnikowych, barwników i znaczników w celu odróżnienia już martwych komórek od tych, które wciąż żyją, ale często działają one tylko przez krótki czas przed blaknięciem i mogą być również toksyczne dla komórek, gdy są stosowane.

„Naprawdę chcieliśmy wskaźnika, który będzie działał przez całe życie komórki — nie tylko przez kilka godzin — a następnie da wyraźny sygnał dopiero po określonym momencie śmierci komórki” — mówi Linsley.

Linsley, Finkbeiner i ich koledzy dokooptowali czujniki wapnia, pierwotnie zaprojektowane do śledzenia poziomu wapnia wewnątrz komórki. Gdy komórka umiera, a jej błony stają się nieszczelne, jednym z efektów ubocznych jest to, że wapń przedostaje się do wodnego cytozolu komórki, który normalnie ma stosunkowo niski poziom wapnia.

Tak więc Linsley zaprojektował czujniki wapnia, aby znajdowały się w cytozolu, gdzie fluoryzują tylko wtedy, gdy poziom wapnia wzrośnie do poziomu wskazującego na śmierć komórki. Nowe czujniki, znane jako genetycznie zakodowany wskaźnik śmierci (GEDI, wymawiane jak Jedi w Gwiezdnych Wojnach), mogą być wstawiane do dowolnego typu komórki i sygnalizować, że komórka jest żywa lub martwa przez całe życie komórki.

Aby przetestować użyteczność przeprojektowanych czujników, grupa umieściła pod mikroskopem duże grupy neuronów — każdy zawierający GEDI. Po wizualizacji ponad miliona komórek, w niektórych przypadkach podatnych na neurodegenerację, a w innych wystawionych na działanie toksycznych związków, naukowcy odkryli, że czujnik GEDI był znacznie dokładniejszy niż inne wskaźniki śmierci komórki: nie było ani jednego przypadku, w którym czujnik byłby aktywowany i komórka pozostała żywa. Co więcej, oprócz tej dokładności, GEDI wydawał się również wykrywać śmierć komórki na wcześniejszym etapie niż poprzednie metody – blisko „punktu bez powrotu” śmierci komórki.

„Pozwala to oddzielić żywe i martwe komórki w sposób, który nigdy wcześniej nie był możliwy”, mówi Linsley.

Wykrywanie nadludzkiej śmierci

Linsley wspomniał o GEDI swojemu bratu – drowi drowi Linsleyowi, adiunktowi na Brown University, który specjalizuje się w stosowaniu sztucznej inteligencji do danych biologicznych na dużą skalę. Jego brat zasugerował, aby naukowcy wykorzystali czujnik w połączeniu z podejściem do uczenia maszynowego, aby nauczyć system komputerowy rozpoznawania żywych i martwych komórek mózgowych tylko na podstawie kształtu komórki.

Zespół połączył wyniki z nowego czujnika ze standardowymi danymi fluorescencyjnymi na tych samych neuronach i nauczył model komputerowy o nazwie BO-CNN rozpoznawania typowych wzorców fluorescencji związanych z tym, jak wyglądają umierające komórki. Model, jak wykazali bracia Linsley, był w 96 procentach dokładny i lepszy niż to, co mogą zrobić ludzcy obserwatorzy, i był ponad 100 razy szybszy niż poprzednie metody różnicowania żywych i martwych komórek.

„W przypadku niektórych typów komórek niezwykle trudno jest ustalić, czy komórka jest żywa czy martwa — ale nasz model komputerowy, ucząc się od GEDI, był w stanie odróżnić je na podstawie części obrazów, których wcześniej nie znaliśmy. były pomocne w rozróżnianiu żywych i martwych komórek”, mówi Jeremy Linsley.

Zarówno GEDI, jak i BO-CNN umożliwią teraz naukowcom przeprowadzenie nowych, wysokowydajnych badań w celu odkrycia, kiedy i gdzie komórki mózgowe umierają – co jest bardzo ważnym punktem końcowym w przypadku niektórych z najważniejszych chorób. Mogą również badać leki pod kątem ich zdolności do opóźniania lub unikania śmierci komórek w chorobach neurodegeneracyjnych. Lub, w przypadku raka, mogą szukać leków przyspieszających śmierć chorych komórek.

„Technologie te zmieniają zasady gry w naszej zdolności do zrozumienia, gdzie, kiedy i dlaczego śmierć następuje w komórkach” — mówi Finkbeiner. „Po raz pierwszy możemy naprawdę wykorzystać szybkość i skalę, jaką zapewniają postępy w mikroskopii wspomaganej przez roboty, aby dokładniej wykrywać śmierć komórki i robić to z dużym wyprzedzeniem przed momentem śmierci. Mamy nadzieję, że może to doprowadzić do bardziej specyficznych terapii dla wielu chorób neurodegeneracyjnych, które do tej pory były nieuleczalne”.